稲のタンパク質 発現解析 ｜ フィールドテスト事例

イネのタンパク質発現の比較解析

2007年　合同研究会より

（日立協和エンジニアリング㈱センター長 武士紀昭 様）
― 成長促進因子！免疫力抗体因子！大幅増加を確認 ―
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生命科学の原点、タンパク質を追跡！

協力
㈱日立ハイテクマニファクチュア＆サービス
ＤＮＡ解析グループによる測定

１.研究会会員新山文氏提供の検体を、
(下図)[１][２][３]の内容で生育したものを測定 

 

２.二次元電気泳動によるタンパク質の確認

まず、2次元電気泳動により発現したタンパク質に有意差があるか確認を実施しました。これは、二段階の電気泳動によりタンパク質を二次元に分離する手法で一次元目は、「等電点電気泳動」により、ゲルの固定化pH 勾配上で等電点の違いによってタンパク質を分離します。二次元目は、「SDS-PAGE」により、分子量の違いによってタンパク質を分離します。

◎：装置はバイオラッド社製品を使用しています。 

◎：スポット比較解析ソフトウェア：PDQuest

等電点電気泳動(1次元目)とSDS－PAGE(2次元目)を組み合わせた方法
↓
2－D Clean-Up Kitによるサンプル調製(塩類、界面活性剤、脂質、核酸などを除去)…約2時間
↓
沈殿物を溶かしたDehydration buffer(膨潤バッファー)でIPG stripを膨潤・・・約16時間
↓
等電点電気泳動(1次元目)・・・12時間以上
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　使用装置：プロティアン IEFセル(BIO-RAD)
Equilibration Buffer(平衡化バッファー)Ⅰ・Ⅱによる平衡化・・・30分×2
↓
SDS-PAGE(2次元目)・・・約5時間
↓使用装置：プロティアン II xi 2-Dセル(BIO-RED)
ゲル染色(銀染色・CBB)・・・2時間～ 

 

３.二次元電気泳動測定結果 

４.発現タンパク質の中で解析対象を選定 

５.質量分析の内容(解析手法) 

次に、前項の2次元電気泳動により分離抽出されたタンパク質（15種）に対し、同定解析を質量分析により実施することにしました。

６.質量分析装置外観 

７.質量分析装置外観 

分子量情報からデータベース検索。 ペプチド分子量群を、酵素の消化規則（K,RのC末側で切断）から考えて、消化前のアミノ酸配列を検索。

 

例）赤いアミノ酸配列が、データベース上のタンパク質と、ペプチド分子量が合致（ヒット）

８.タンパク質同定結果 

結論
ハイエット処理水を使用して生育させたイネの根部から、有為的に発現したタンパク質を抽出し同定解析した結果、以下の知見が得られました。
・植物に病原菌が感染した際に発現することが知られている“感染特異的タンパク質
（PR-Proteins）”が複数個検出された。
（spot No. 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14）
・細胞壁の構成に関連するActin-depolymerizing factorも同定され（spot No.12）、 植物の伸長成長に関わる因子も検出された。
　 但し、このタンパク質の発現が、成長を促進するために発現したか、あるいは成長した結果として発現量が増加しているのかは この実験からは決めることはできない。
　 尚、今回のデータは提供されたサンプルのタンパク質発現についての結果を述べたものです。

研究所考察
今回、ミクロの世界の解析として、㈱日立協和エンジニアリング様より大変貴重なデータが得られました。
写真でもわかる様に、全く同じ種子でも、ハイエット水処理によってその形態・大きさに差が出ている以上、それを支援するタンパク質に「ミクロの目」が入ったことは、将来、成長因子タンパクについて何らかの研究成果が出てくるものと期待されます。
特に、免疫機能と考察される病原タンパクについては、全ての生物の特性としての抗体機能との関連もあり、誠に興味深いものと考えております。
常温・常圧で亜臨界流体を生成するハイエットは、生命科学の研究装置としても極めて重要なテーマ・情報を提供する事が可能となりました。
測定にあたられたスタッフの方々、お疲れ様でした。